科研服務 > 第二代定序 > 植物降解組

 
植物 miRNA 與 mRNA 完全或接近完全的配對結合後， 會引起目標基因在配對的第十位核酸上發生剪切，進行基因表達的調控。 伴隨第二代定序的進步，利用 PARE* (Parallel Analysis of RNA Ends) 方法， 以降解組定序（Degradome Sequencing）測出剪切位點， 被剪切的 3’ 片段以 RNA 連接酶連接上 5’ adaptor 後， 經反轉錄形成雙股 cDNA， 再以 EcoP 15I** 酵素切位接上 3’ adaptor 後往下進行定序分析。 目前此方法已成功應用於阿拉伯芥，水稻等植物的降解組定序上。
 
   
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  * German, M.A., Pillay, M., Jeong, D.H., Hetawal, A., Luo, S., Janardhanan, P., Kannan, V., Rymarquis, L.A., Nobuta, K., German, R. et al. (2008) Global identification of microRNA-target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends. Nat Biotechnol, 26, 941-946.  
 
  **Addo-Quaye, C., Snyder, J.A., Park, Y.B., Li, Y.F., Sunkar, R. and Axtell, M.J. (2009) Sliced microRNA targets and precise loop-first processing of MIR319 hairpins revealed by analysis of the Physcomitrella patens degradome. RNA, 15, 2112-2121.  
 
   機型 / 軟體
  • Illumina Genome Analyzer IIx
  • CleaveLand 分析軟體*

    * Addo-Quaye, C., Miller, W. and Axtell, M.J. (2009) CleaveLand: a pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets. Bioinformatics, 25, 130-131.

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       報告範例
    以 CleaveLand 分析軟體分析進行數據的處理， 第一步先扣除 structural RNAs 序列， 再與 cDNA 資料庫進行比對， 選取條件相符的序列與 small RNAs 資料庫進行互補性比對， 去除雜訊後，會得到 miRNA 結合到 mRNA 的位置， 再依所計算出的剪切位可靠性進行分類，由高至低依序為 Category 0 ～ 4 (Category 0 表示可靠性最高)， 並以 T-plot 圖示分析的結果。
    • 剪切點可靠性分群
    以 PC-5p-50747 miRNA 的目標基因 AT2G34480 為例， 其與 PC-5p-50747 配對結合後， 會在此基因的第 520 個鹼基 Adenine (如表最下方的 * 處) 進行剪切。 將 Reads 分析整理後，依據剪切點的可靠性進行分群 (如下表)。
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    Category 分類的定義如下：
    Category 0 : 在目標基因中只有出現一個剪切位，且此位置在該基因的 Reads 數最高；
    Category 1 : 有一個以上的剪切位，且這些位置在該基因的 Reads 數皆最高；
    Category 2 : 判定的剪切點，Reads 數高於該基因的平均 Reads 數，
                            但其少於該基因 Reads 數最高的片段；
    Category 3 : 判定的剪切點，Reads 數少於該基因的平均 Reads 數；
    Category 4 : 判定的剪切點，但 Reads 數只為 1。
    • T-plot 圖
    X 軸為 AT2G34480 基因 cDNA 全長位置， Y 軸為經校正過後的 Reads 數， 紅色 pick 為經軟體判定為剪切點， 可由 t-plot 圖觀察是否具可靠性。
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